小鼠主動脈內(nèi)皮細胞是研究血管生物學(xué)、動脈粥樣硬化、炎癥反應(yīng)及藥物篩選的重要模型。其分離與培養(yǎng)技術(shù)對于心血管疾病的研究至關(guān)重要。本文詳細介紹小鼠主動脈內(nèi)皮細胞的分離、純化和培養(yǎng)方法，以確保獲得高純度和高活性的細胞。
實驗材料與儀器
試劑
-磷酸鹽緩沖液（PBS，無鈣鎂）
-膠原酶（TypeII，0.1%-0.2%）
-內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基（如DMEM/F12+20%FBS+1%ECGS+1%青霉素/鏈霉素）
-70%乙醇（用于消毒）
-紅細胞裂解液（可選）
儀器與耗材
-超凈工作臺
-CO?培養(yǎng)箱（37°C，5%CO?）
-手術(shù)器械（眼科剪、鑷子、顯微鑷）
-細胞篩（100μm和40μm）
-離心機
-0.1%明膠包被的培養(yǎng)皿
實驗步驟
1.小鼠主動脈的獲取
1.小鼠：采用CO?窒息或頸椎脫臼法處死小鼠，并用70%乙醇消毒體表。
2.解剖主動脈：
-沿腹中線剪開胸腔和腹腔，暴露心臟和主動脈。
-用鑷子輕輕提起心臟，剪斷主動脈弓，并沿胸主動脈向下分離至髂動脈分叉處。
-將主動脈完整取出，置于預(yù)冷的PBS中，去除周圍脂肪和結(jié)締組織。
2.主動脈消化與內(nèi)皮細胞分離
1.酶消化法：
-將主動脈縱向剪開，用PBS沖洗3次以去除血液。
-浸泡于0.1%-0.2%膠原酶溶液中（37°C，15-30分鐘），期間輕柔振蕩促進消化。
-消化完成后，加入含血清的培養(yǎng)基終止反應(yīng)。
2.細胞收集：
-用移液槍反復(fù)吹打主動脈碎片，釋放內(nèi)皮細胞。
-過100μm和40μm細胞篩去除未消化組織，收集細胞懸液。
-離心（1000rpm，5分鐘），棄上清，用內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基重懸細胞。
3.內(nèi)皮細胞的純化
-差速貼壁法：將細胞懸液接種于未包被的培養(yǎng)皿中（37°C，1小時），使成纖維細胞優(yōu)先貼壁，隨后收集未貼壁的內(nèi)皮細胞。
-磁珠分選（可選）：使用CD31或CD144抗體標(biāo)記內(nèi)皮細胞，通過磁珠分選提高純度。
4.內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)
1.培養(yǎng)皿包被：使用0.1%明膠（37°C，1小時）或纖連蛋白包被培養(yǎng)皿，提高內(nèi)皮細胞貼壁率。
2.細胞接種：將純化的細胞接種于包被的培養(yǎng)皿中，加入內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基（含20%FBS和ECGS）。
3.培養(yǎng)條件：
-37°C，5%CO?，飽和濕度培養(yǎng)。
-每2-3天換液一次，觀察細胞形態(tài)（呈鵝卵石樣鋪路石狀）。
4.傳代：當(dāng)細胞融合度達80%-90%時，用0.25%胰酶消化傳代（1:2或1:3比例）。
注意事項
1.無菌操作：所有步驟需在超凈臺內(nèi)進行，避免污染。
2.消化時間控制：膠原酶消化時間過長可能導(dǎo)致細胞損傷，需優(yōu)化實驗條件。
3.細胞鑒定：可通過免疫熒光檢測CD31、vWF或eNOS等內(nèi)皮標(biāo)志物確認細胞純度。
4.避免過度傳代：原代內(nèi)皮細胞傳代次數(shù)建議不超過5代，以防表型丟失。
更新時間：2025-08-14
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